정확한 결과를 위한 내구성이 뛰어난 UV Vis 기기
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제품 & 기술사양
Wavelength range
Photometric accuracy (K2Cr2O7)
Wavelength accuracy
Resolution (Toluene in hexane)
Stray light (KCl, 198nm)
제품 브로슈어
FastTrack™UV/VIS기술은 추적 가능한 높은 정확도와 함께 빠르고 신뢰성 있는 측정을 좁은 공간에서도 가능하도록 최첨단의 분광시스템으로 설계되었습니다. UV/VIS Excellence의 빠르고 간단한 작업은 지속적이고 신뢰성 있는 시험결과 도출을 위해 Fast...
The UV/VIS Excellence instruments for Life Sciences effectively optimize spectroscopic workflows as the instruments are always ready for measurement....
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하루에도 몇 번씩 하는 흡광도 측정! 제대로 알고 하자!
DNA와 RNA 등 핵산 정량, Bradford assay와 BCA assay 등 다양한 방법의 단백질 정량. 바이오 실험을 하는 연구자라면
하루에도 몇 번씩 시료의 흡광도를 측정하고 있다.
그렇다면 흡광도는 어떤 원리로 측정되는 것이며, 흔히 얘기하는 OD값(optical density)은 무엇일까?
이 원리를 이해하기 위해서는 아래 두가지 원리를 이해해야 한다.
1. Lamber-Beer의 법칙
2. 모든 물질은 고유의 흡광 파장을 갖는다
Lamber와 Beer는 각각 하나의 원리를 찾고 법칙을 성립했다.
Lamber는 ‘흡광도’와 ‘빛이 지나간 길이’가 비례함을 확인했는데, 그림으로 확인하면 아래와 같다.
만약 위와 같이 길이가 다른 큐벳(cuvette)에 같은 물질(ex.물)을 넣고 한쪽에서 빛을 쏘아주면, 그 물질이 빛의 일부를 흡수한다.
흡수되지 않은 남은 빛은 물질을 통과하여 반대편에서 측정된다.
그런데 샘플을 향해 쏘아준 빛(그림에서 100%)은 큐벳 길이가 길수록 더 많은 물분자를 만난 후 반대편으로 통과된다.
따라서 각각의 물분자들이 모두 빛을 흡수했으므로 큐벳 길이가 길수록 반대편으로 통과된 빛은 적을 것이다.
즉 반대편으로 통과되어 나오는 투과율은 흡수층의 두께(빛이 샘플을 지나간 길이)에 반비례하며, 샘플의 흡광도는 흡수층의 두께에 비례한다.
다음은 Beer의 법칙이다. 아래 그림과 같이 특정 물질이 농도별로 들어있는 시료가 있다.
같은 길이의 큐벳을 사용하여 흡수층의 두께(큐벳의 길이)는 동일하다.
이 경우 장비에서 넣어준 빛 대비 시료를 통과하여 투과된 빛의 양은 어떨까?
Lamber의 법칙에서 설명한대로, 각각의 물질 분자는 빛을 흡수한다. 따라서 고농고일수록 시료 내에 빛을 흡수할 수 있는 분자가 더 많이 존재하는 것이다.
즉 반대편으로 통과되어 나오는 투과율(10%, 1%, 0.1%)은 시료의 농도에 반비례하며, 시료의 흡광도는 농도에 비례한다.
흡광도 측정에 사용되는 두번째 원리는 ‘모든 물질은 고유의 흡광 파장을 가진다’는 것이다.
예를들어 아래 그림은 순수한 물의 흡수 스펙트럼이다.
(이미지 출처: //www.researchgate.net/figure/3-Absorption-spectrum-of-pure-water_fig16_314448200)
보는 것과 같이 물은 970 – 980 nm 파장의 빛을 가장 많이 흡수하는 것을 볼 수 있다.
이처럼 물 뿐만 아니라 모든 물질은 고유의 흡광 파장을 갖고있다.
우리가 핵산을 260 nm에서 측정하는 것도 이 원리를 이용한 것인데, 핵산의 최대 흡수 파장이 260 nm이기 때문이다.
즉, 내 시료가 260 nm 빛을 많이 흡수하면 핵산 농도가 높은 것으로 이해하는 셈이다.
그렇다면 위의 원리들이 OD값에 어떻게 적용될까?
우선 흡광도와 투과율의 관계는 아래와 같다.
흡광도 측정 장치는 시료를 투과하여 나온 I1을 측정하여, 역으로 시료의 흡광도를 계산한다.
따라서 투과된 빛이 많으면 많을수록 시료가 흡수한 빛은 적은 셈이다.
이 때문에 흡광도와 투과율은 정비례가 아닌 반비례 그래프인 ‘-log’를 사용한다.
위 그림에서 Transmssion은 I0/I1 = 10% 이고, 10%=0.1=10-1으로 표기할 수 있다. 따라서 -log10-1 = 1이다.
이 수식을 적용하면 일반적으로 흡광도 측정장치에서 사용되는 ~OD4가 의미하는 흡광도는 아래와 같다.
위 수식을 통해 투과율을 가지고 흡광도를 계산할 수 있다. 그렇다면 이를 시료의 농도에 어떻게 반영할 수 있을까?
이 때, 추가로 ε(물질 고유의 흡광계수)와 l(cuvette의 폭) 정보가 필요하다.
A = ε l c
A: 흡광도
Ε: 물질 고유의 흡광계수
l: pathlength (cuvette의 폭 혹은 마이크로플레이트의 용액 높이)
c:흡광물질의 농도
ε (물질 고유의 흡광계수)는 ‘특정 물질이 특정 파장의 빛을 얼마나 흡수하는가’를 나타내는 지표라고 할 수 있다.
예를들어 double strand DNA의 260 nm에서 ε값은 50이며, single strand RNA는 40이다.
이러한 정보는 인터넷을 통해 얻을 수 있다.
이는 표준용액을 사용하지 않는 ‘절대정량’에 활용하기 위한 방법이다.
만약, 마이크로플레이트를 사용하여 농도를 알고있는 표준용액과 함께 정량을 하고있는 경우라면,
ε값과 l값을 확인하지 않아도 무방하다.
동량의 시료를 넣으므로써 l값은 고정되기 때문이며, 표준용액을 통한 정량이므로 ε값도 통제된다.
즉, 표준용액의 농도와 흡광도 관계를 확인하므로써, 내 시료의 흡광도를 통해 농도를 알아내는 방식이다.
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